Alors que la microscopie à fluorescence s’est traditionnellement concentrée sur le spectre visible, l’avènement des appareils photo numériques sensibles aux longueurs d’onde au-delà du spectre visible a ouvert un éventail de possibilités dans les gammes ultraviolette et infrarouge.
Microscopie proche infrarouge (NIR) pour l’imagerie de cellules vivantes
Protégez vos cellules vivantes, simplifiez vos protocoles expérimentaux et obtenez des données plus précises grâce à la microscopie proche infrarouge (NIR) et à ondes courtes (SWIR). Les photons infrarouges, de plus faible énergie et de plus grande longueur d’onde, sont moins cytotoxiques que les photons de plus courte longueur d’onde et de plus haute énergie présents dans les bandes visible et ultraviolette du spectre. En évitant la phototoxicité indésirable, les cellules peuvent être étudiées plus longtemps. La microscopie NIR permet de gagner du temps, de réduire les coûts et de simplifier les procédures en éliminant le recours à des marqueurs bioluminescents complexes codés génétiquement, tels que la luciférase, dans de nombreuses études sur cellules vivantes.
Choisir le bon système optique pour la microscopie NIR
Pour des performances optimales, il est recommandé d’utiliser des objectifs optimisés pour l’infrarouge. Consultez le diagramme de transmission (fig. 2) de l’objectif dans sa fiche technique afin de vérifier que les longueurs d’onde que vous souhaitez utiliser transmettent une quantité de lumière suffisante. La faible intensité des signaux de fluorescence implique que même une légère diminution de l’efficacité de transmission de l’objectif aura un impact direct sur la durée d’exposition nécessaire à une détection fiable. Des temps d’exposition plus longs se traduisent par un débit réduit.
Figure 2. Courbes de transmission infrarouge de l’objectif Nikon Plan Acromat recommandé pour l’imagerie infrarouge et de l’objectif Plan Acromat standard. Ces courbes ne donnent pas à elles seules une image complète. Consultez les recommandations du fabricant concernant les plages de longueurs d’onde nominales.
Les fabricants peuvent également formuler des recommandations spécifiques concernant la plage de longueurs d’onde nominale des objectifs. Bien qu’un objectif puisse présenter une transmission acceptable pour une longueur d’onde donnée, il peut ne pas offrir une mise au point optimale ou produire des aberrations chromatiques indésirables s’il est utilisé en dehors de sa plage nominale.
Outre les objectifs, les performances NIR d’un microscope dépendent également de sa lentille tubulaire. Sur de nombreux systèmes de microscopie, le remplacement des composants optiques peut s’avérer coûteux et complexe, voire impossible. La plateforme modulaire Nucleus® de Zaber simplifie la prise en main de l’imagerie NIR. L’installation d’une lentille tubulaire NIR prend moins d’une minute ! De même, l’ajout d’un éclairage NIR au système ne prend que deux minutes. Des modules d’éclairage avec les longueurs d’onde LED de votre choix sont disponibles sur demande.
Figure 3. Courbe de transmission d’une lentille tubulaire optimisée pour l’infrarouge comparée à celle d’une lentille tubulaire standard. L’efficacité de transmission de la lentille tubulaire standard chute brutalement au-delà de 800 nm.
À mesure que l’épaisseur du tissu entre la surface de l’échantillon et le plan focal augmente, le nombre de fluorophores hors foyer excités augmente également. La lumière émise par ces fluorophores hors foyer peut créer un voile qui rend difficile l’identification des signaux faibles. Les outils de traitement par IA, tels que ceux disponibles dans Viziview, permettent d’éliminer ce voile et d’améliorer le rapport signal/bruit.
Sélection de la caméra pour la microscopie NIR
Les performances des caméras CMOS et CCD dépendent de la longueur d’onde. Le pourcentage de photons incidents qui parviennent à arracher des électrons aux atomes de silicium de la photodiode du capteur d’image est appelé rendement quantique (QE). Aux longueurs d’onde supérieures à 850 nm, le rendement de la plupart des capteurs d’image CMOS est inférieur à 50 % (fig. 3).
Figure 4. Courbe d’efficacité quantique d’une caméra sCMOS moderne et performante par rapport à des objectifs optimisés pour l’IR et l’UV. L’efficacité quantique maximale des capteurs d’image en silicium se situe généralement aux alentours de 525 nm.
Cela nécessitera des temps d’exposition plus longs et/ou un gain de capteur plus élevé pour capturer des images d’une luminosité équivalente à celle des fluorophores émettant une lumière à des longueurs d’onde plus proches du rendement quantique maximal de votre caméra. Cet article de Zaber propose une analyse plus approfondie du choix de la caméra pour la microscopie.
Considérations particulières relatives à la microscopie NIR
La résolution spatiale maximale de vos images dans le plan XY diminue à mesure que les longueurs d’onde utilisées augmentent. Cette relation est décrite par la formule de résolution limite de diffraction d’Abbe : d = λ/(2NA).
La résolution spatiale limitée par la diffraction dans le plan latéral est égale à la longueur d’onde divisée par deux fois l’ouverture numérique. Une discussion approfondie des avantages et des inconvénients des objectifs à différentes ouvertures numériques dépasse le cadre de cet article. Toutefois, en général, les objectifs à ouverture numérique plus élevée offrent une meilleure résolution spatiale et captent davantage de lumière, ce qui se traduit par des images plus lumineuses. En revanche, leur profondeur de champ est plus faible, ce qui peut constituer un avantage ou un inconvénient selon l’application.
La longueur d’onde d’excitation élevée et les longueurs d’onde d’émission encore plus élevées des fluorophores NIR comme le Cy7 permettent une pénétration plus profonde dans les tissus, rendant possible la microscopie de fluorescence des cellules dans un microenvironnement plus naturel. Cependant, cette pénétration plus profonde peut entraîner une diminution du rapport signal/bruit.
Figure 5. L’illumination NIR pénètre plus profondément dans les tissus. Cette meilleure pénétration peut entraîner l’excitation d’un plus grand nombre de fluorophores en avant et en arrière du plan focal. Bien que flous, ces fluorophores émettent une lumière qui crée un voile sur l’image, diminuant ainsi le rapport signal/bruit.
Microscopie NIR et SWIR pour l’inspection des semi-conducteurs
Les longueurs d’onde NIR et SWIR pénètrent plus profondément dans les substrats de silicium, faisant de la microscopie NIR un outil précieux pour le développement et le contrôle des semi-conducteurs. Les progrès réalisés en matière d’intégration et d’empilement des puces favorisent le développement de conceptions avancées à base de chiplets, susceptibles d’introduire des défauts sous-jacents tels que des interconnexions traversantes (TSV) mal alignées et des fissures dues aux contraintes d’encapsulation. La microscopie infrarouge permet de détecter ces défauts.
Microscopie ultraviolette (UV) pour une résolution accrue
Résolvez des détails plus fins grâce à la microscopie UV. La résolution spatiale accrue qu’offre l’imagerie UV est idéale pour les applications d’inspection de semi-conducteurs et de surfaces où la précision des détails est primordiale et où la phototoxicité n’est pas un problème. Les longueurs d’onde plus courtes de l’UV permettent une résolution spatiale supérieure à celle des longueurs d’onde plus longues du visible et de l’infrarouge. C’est l’inverse du phénomène observé pour l’infrarouge décrit précédemment. La microscopie UV est également fréquemment utilisée dans l’industrie pharmaceutique pour mesurer la dispersion des principes actifs dans les formulations et identifier les contaminants potentiels.
La microscopie UV présente de nombreuses limitations similaires à celles de la microscopie NIR. Comme pour cette dernière, des objectifs spécifiques sont nécessaires, dotés de matériaux optiques et de revêtements optimisés pour la transmission des courtes longueurs d’onde. Les objectifs optimisés pour l’UV portent généralement la mention « Fluor » ou « Fluar » dans leur nom. Par exemple, la série CFI Plan Fluor de Nikon .
Figure 6. Courbe de transmission de l’objectif optimisé Nikon Super Fluor UV comparée à celle de l’objectif standard.
Optimiser un microscope pour des performances optimales dans l’ultraviolet (UV) est plus exigeant que pour le proche infrarouge (NIR). Les lentilles de tube, les illuminateurs et les caméras optimisés pour l’UV nécessitent des matériaux optiques et des traitements plus sophistiqués que pour les systèmes optimisés pour le NIR. Cela se reflète dans le coût de ces composants. Par exemple, un objectif Mitutoyo 50X de haute qualité, optimisé pour l’imagerie dans le spectre visible, coûte environ 3 500 USD, tandis qu’un objectif optimisé pour l’UV, avec le même grossissement et la même ouverture numérique, coûte environ 18 000 USD.
Figure 7. Courbe de transmission d’une lentille tubulaire optimisée pour les UV comparée à celle d’une lentille tubulaire standard. L’efficacité de transmission de la lentille standard est pratiquement nulle pour les longueurs d’onde inférieures à 350 nm. L’efficacité de transmission de la lentille tubulaire optimisée pour les UV chute très rapidement pour les longueurs d’onde supérieures à 400 nm.
Les photons UV de haute énergie peuvent endommager les matériaux biologiques. L’imagerie UV est déconseillée pour l’imagerie cellulaire en temps réel en raison de sa phototoxicité. Les yeux humains font également partie des matériaux biologiques sensibles aux UV. Il est impératif de respecter scrupuleusement les précautions d’usage lors de l’utilisation d’un microscope UV. Ne regardez jamais directement un échantillon éclairé par les UV sans protection oculaire adaptée ! L’éclairage UV peut également dégrader les adhésifs utilisés sur les guides de lumière liquides. Ces composants doivent être inspectés régulièrement et remplacés si nécessaire.
La microscopie de fluorescence UV et NIR s’impose comme un outil essentiel pour les applications dans les domaines des semi-conducteurs et des sciences de la vie. La capacité d’imager des substrats de silicium avec une résolution accrue, voire en profondeur, et d’observer des cellules vivantes sur de longues périodes sans risque de phototoxicité constitue un atout précieux.
Si la mise à niveau de nombreux systèmes de microscopie existants peut s’avérer complexe (et coûteuse), les microscopes modulaires, tels que la plateforme de microscopie automatisée modulaire Nucleus de Zaber, facilitent la prise en charge de l’imagerie infrarouge et ultraviolette. Des systèmes optiques et d’éclairage spécifiques à chaque longueur d’onde sont disponibles sur demande, avec des délais de livraison de seulement deux semaines, et peuvent être changés en moins de cinq minutes.
